RESUMO

Objetivos: Avaliar as interações das variáveis psiconeuroendócrinas na regulação da função das células T durante o envelhecimento saudável.
Métodos: Participaram neste estudo, 45 idosos saudáveis (72,0 ± 8,5 anos) e 33 jovens, (28,0 ± 6,8 anos) recrutados pelo protocolo SENIEUR. O estado emocional (depressão, ansiedade e estresse) foi obtido através de entrevistas estruturadas e amostras de saliva foram coletadas (9h, 12 h e 22 h) para dosagem de cortisol (radioimunoensaio). As células mononucleares do sangue periférico foram isoladas, estimuladas in vitro com fitohemaglutinina e glicocorticóides (dexametasona ou cortisol) e cultivadas por 96h (37° C e 5% de CO2). A proliferação foi avaliada através de um ensaio colorimétrico (MTT).

Resultados: Os idosos apresentaram-se mais estressados, ansiosos e deprimidos que os jovens. Paralelamente, os idosos apresentaram níveis aumentados de cortisol. Os linfócitos dos idosos apresentaram-se mais resistentes ao tratamento in vitro com dexametasona (p = 0,006) em relação ao grupo de jovens. Além disso, linfócitos de idosos estressados eram mais sensíveis ao tratamento com DEX do que idosos não estressados.
Conclusões: Nossos resultados sugerem que o envelhecimento saudável está associado com importantes alterações psiconeuroendócrinas que foram associadas com a imunidade celular.

UNITERMOS: linfócitos, proliferação, glicocorticóides, estresse psicológico,

ABSTRACT

Objectives: To evaluate the psychoneuroendocrine interactions involved with the regulation of T-cell function during healthy aging.
Material and methods: Forty five healthy elderly (72.0 ± 8.5 yrs) and 33 young subjects (28.0 ± 6.8 yrs) were recruited by the SENIEUR protocol. Psychological status (depression, anxiety and stress) was assessed by structured interviews and salivary samples collected (9, 12 and 22h) for measuring cortisol levels (radioimmunoassay). Peripheral blood mononuclear cells were isolated, stimulated in vitro with phytohemagglutinin (PHA) and glucocorticoids (dexamethasone, DEX, or cortisol) and cultured for 96 h (37°C, 5% CO2). Proliferation was assessed by a colorimetric assay (MTT).

Results: The elders were more stressed, anxious and depressed than young subjects. Similarly, the elders had increased cortisol levels. Lymphocytes from elders were more resistant to DEX treatment in vitro (p = 0.006). Furthermore, lymphocytes from stressed elders were more sensitive to DEX treatment than non stressed elders.
Conclusions: Our data suggest that healthy aging is associated with significant psychoneuroendocrine alterations that were associated with the cellular immunity.

KEY WORDS: lymphocyte, proliferation, glucocorticoids, psychological stress

INTRODUÇÃO

O envelhecimento está associado com alterações em diversos sistemas, inclusive no sistema imune. Estas alterações incluem disfunções na resposta imune humoral, processamento de antígenos e respostas celulares (1). Embora existam resultados controversos na literatura, várias evidências indicam uma redução na resposta imune celular – em particular uma disfunção dos linfócitos T. As conseqüências clínicas da disfunção imunológica incluem suscetibilidade aumentada para doenças infecciosas, neoplasias e doenças auto-imunes.
Vários mecanismos estão implicados na imunossenescência (envelhecimento do sistema imunológico) das células T (2), incluindo: i) defeitos na hematopoiese, ii) involução tímica, iii) defeitos nas células apresentadoras de antígenos, iv) defeitos na ativação e transdução de sinais, v) senescência replicativa das expansões clonais, e vi) disfunção neuroendócrina. Em relação ao último, alguns autores demonstraram que os níveis séricos de cortisol (hormônio do estresse) aumentam progressivamente no envelhecimento (3). O aumento dos níveis de cortisol poderia contribuir para a imunossenescência.

O estresse psicológico, através da ativação do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA), eleva intensamente os níveis de glicocorticóides que alteram o sistema imunológico. Durante o estresse, os glicocorticóides podem suprimir vários componentes celulares do sistema imune (4) e, dessa maneira, aumentando a morbidade e mortalidade de populações cronicamente estressadas. Isso é particularmente importante para o idoso que apresenta uma maior vulnerabilidade às infecções como conseqüência da imunossenescência. Esse aumento de susceptibilidade às doenças não está distribuído homogeneamente nas populações e, dessa forma, devem receber influências de outros fatores imunomodulatórios, tais como, fatores psicológicos e neuroendócrinos. De fato, estudos anteriores demonstraram que idosos sob estresse crônico (i.e. cônjuges de pacientes com Alzheimer) exibem uma importante redução da proliferação de linfócitos T in vitro (5) e fraca resposta à vacinação por influenza (6). Logo, fatores psicológicos devem ser considerados como fatores de risco importantes para o imunossenescência. Essas alterações foram associadas a um aumento dos níveis de cortisol salivar, sugerindo que alterações neuroendócrinos no envelhecimento estão associadas a uma disfunção na ativação do eixo HPA (3). Entretanto, nenhum estudo investigou o papel das variáveis psiconeuroendócrinas na regulação da resposta imune de idosos saudáveis. Logo, o entendimento das interações entre o sistema imune, endócrino e nervoso, bem como a contribuição das mesmas na imunossenescência é de grande relevância.

Com base nestas considerações, os objetivos deste estudo são: i) investigar se o envelhecimento saudável está associado a alterações psicológicas e endócrinas; ii) avaliar a proliferação de linfócitos induzida por mitógenos, iii) a sensibilidade linfócitos a glicocorticóides in vitro; e iv) analisar o impacto do estado emocional sobre a proliferação linfocitária e sensibilidade a glicocorticóides.

POPULAÇÃO E MÉTODOS

Sujeitos

Estudo de coorte prospectivo, onde foram incluídos 46 idosos saudáveis (31 mulheres, 15 homens), não institucionalizados, com idades entre 65 a 91 anos. Os idosos foram recrutados a partir de um banco de dados existente de 1118 idosos socialmente ativos que participaram previamente em pesquisas no Instituto de Geriatria e Gerontologia (PUCRS). Todos os indivíduos eram registrados na Central de Serviço Social de Gravataí (RS) e que participavam do Programa GÊNESE para o estudo nas interações genético-ambientais no envelhecimento de humano. Trinta três adultos jovens saudáveis (18 mulheres, 15 homens), idade entre 20 e 40 anos, também fizeram parte do estudo. O termo de consentimento informado foi obtido de todos os participantes do estudo e o estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da PUCRS. Todos os indivíduos desse estudo foram admitidos de acordo com o protocolo SENIEUR (adaptado da European Community’s Concerted Action Programme on Aging) que define critérios rigorosos de saúde para estudos imunogerontológicos, permitindo a análise do processo de envelhecimento isoladamente (7). Os critérios de exclusão incluem a presença de várias doenças ou uso de medicamentos que podiam influenciar o sistema imune.

Variáveis psicológicas

Os escores psicológicos foram levantados através de entrevistas estruturadas e instrumentos psicométricos validados para depressão (Escala de Depressão Geriátrica de (8) com ponto de corte (>5) para a presença de sintomas de depressivos (9), para ansiedade (Escala de Ansiedade de Hamilton) com ponto de corte (>20) a presença de ansiedade Hamilton, 1967 e para a presença e levantamento de sintomas de estresse foi utilizado o "Inventário de Sintomas de Estresse para Adultos" (ISSL) (10). O ISSL está composto de quatro estágios que correspondem às seguintes fases de estresse: alarme, resistência, quase exaustão e exaustão. Os sintomas listados na escala são específicos para cada fase do estresse. A contagem foi realizada através de três fases diferentes relacionadas ao tempo de duração (Q1 = últimas 24h, Q2 = última semana e Q3 = último mês) e a intensidade dos sintomas de estresse. A soma de todos sintomas físicos e psicológicos dentro de cada fase resultada em um escore. A presença de estresse está relacionada com escores superiores aos específicos de cada fase que são: Q1 > 6 ou Q2 > 3 ou Q3 > 8. Os coeficientes confiança para todos os instrumentos eram utilizados eram superiores a 0.90.

Coleta e análises de cortisol salivar

O cortisol salivar foi mensurado como um marcador biológico da atividade do eixo HPA. A análise hormonal salivar constitui um método não invasivo e livre de estresse, capaz de representar a fração livre (biologicamente ativa) deste hormônio na circulação sanguínea (11), este corresponde de 5-10% dos níveis séricos (12) e não sofre interferências pela globulina ligadora de glicocorticóides (CBG) (11). A avaliação de cortisol na saliva é, então, uma ferramenta poderosa para investigação da função do eixo HPA no envelhecimento. Foram realizadas coletas de três amostras de saliva, realizada com ajuda de rolos de algodão no dia experimental as 9, 12 e 22 horas. No laboratório, as amostras foram centrifugadas e congeladas a -20°C. Amostras de cortisol salivares foram realizadas por radioimunoensaio (RIA, DPC Medlab) A sensibilidade do ensaio era de 0,1 nM/l e os coeficientes intra e interensaios apresentaram uma variação menor que 10%. Os resultados estão expressos em nmol/L.

Isolamento das células mononucleares

Vinte mililitros de sangue periférico foram coletados pela manhã (entre 9 – 10h) em tubos heparinizados. As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas através de centrifugação (900 g, 30 min) sob um gradiente de Ficoll-Hypaque (Sigma). As células foram contadas por microscopia (100 x) e viabilidade celular foi avaliada por critérios de exclusão com azul de trypan (Sigma) e estimada em torno de 95% de viabilidade.
Teste de proliferação de celular e sensibilidade a glicocorticóides

As PBMCs foram cultivadas numa concentração final de 1,5 x105 células/ml em meio de cultura completo (RPMI-1640, com gentamicina 0.5%, glutamina 1%, hepes 1%, e soro fetal bovino 10%, Sigma) por 96 h a 37°C em atmosfera de 5% de CO2. As PBMCs foram estimuladas com fitohemaglutinina (PHA, Gibco) concentrações de 0,5, 1,0 e 2,0% em triplicatas (100 µl/poço) Para avaliar a sensibilidade a glicocorticóides in vitro, 10-9 a 10-4 M de dexametasona ou cortisol foram adicionadas em duplicatas (50 µl/poço; Sigma) nas culturas de linfócitos estimuladas por PHA 1%. A proliferação foi estimada através do ensaio colorimétrico modificado (13) que utiliza o sal de tetrazólio (MTT) que possibilita correlacionar a absorbância com a quantidade de células viáveis. Nas últimas quatro horas de cultura, MTT é adicionado nas culturas de células e após a incubação, os cristais formados foram solubilizados pela adição de dimetil-sulfóxido (DMSO). As absorbâncias foram lidas em leitor de placas de ELISA.

Análise estatística

Todas as variáveis foram testadas para normalidade de distribuição por meio do teste de Kolmogorov-Smirnov. Os dados de proliferação e análise de cortisol foram analisados pela análise de variância (ANOVA) para medidas repetidas que incluiu o grupo (idosos vs. jovens) e as concentrações de mitógeno, glicocorticóides ou cortisol. Comparações múltiplas entre as médias significativas foram checadas através do teste de Bonferroni. As diferenças entre as variáveis também foram avaliadas pelo teste t. As diferenças entre as proporções dos grupos foram avaliadas pelo teste de x2. Os resultados são expressos como média ± SE em todas as figuras e tabelas.

RESULTADOS

Descrição da população e avaliação psicológica

A Tabela 1 lista os dados demográficos e resultados da avaliação psicológica dos indivíduos. A maioria dos idosos e dos jovens adultos era Caucasiana. A relação entre homens e mulheres não diferiu significativamente entre idosos e jovens. Nós observamos que os idosos apresentavam escores mais altos para depressão (p = 0,005), ansiedade (p = 0,001) e estresse (p = 0,001) que os adultos jovens (Tabela 1). Além disso, a maioria dos idosos (76.1%) apresentou mais sintomas de estresse quando comparados com jovens (27.3%), p < 0,0001. Estes dados sugerem que os idosos estritamente saudáveis estão significativamente estressados.

Tabela 1. Características gerais da amostra e avaliação psicológica.

Escores de estresse: Q1 = últimas 24h, Q2 = última semana e Q3 = último mês.
NS = não significativo.

Cortisol salivar

Nós avaliamos a função do eixo HPA através de coletas múltiplas de saliva. Ambos grupos apresentaram uma variação circadiana normal, com um pico de cortisol pela manhã e um nadir à noite (Figura 1). Verificou-se que os níveis de cortisol salivar eram significativamente elevados nos idosos quando comparados aos jovens adultos, F(1,71) = 5,04, p = 0,02. Estes dados sugerem que envelhecimento saudável seja associado com uma ativação significativa do eixo de HPA.



Figura 1. O envelhecimento humano está associado com aumento significativo dos níveis salivares de cortisol ao longo do dia. As diferenças estatisticamente significativas estão indicadas, * p < 0,05.

Proliferação celular e sensibilidade para glicocorticóides

A proliferação celular induzida por mitógenos foi avaliada como um índice de imunidade celular não específica. O teste ANOVA para medidas repetidas revelou que nos idosos tiveram uma proliferação celular significativamente mais baixa que os jovens, F(1,68) = 14.82, p < 0,0001 (Figura 2).


Figura 2. O envelhecimento saudável está associado com uma proliferação de linfócitos diminuída. Foram estimulados PBMCs com fitohemaglutinina (PHA) por 96h e a proliferação quantificada através do ensaio de MTT. As diferenças significativamente estatísticas estão indicadas, * * p < 0,01.

Devido às evidências que, durante exposição crônica a glicocorticóides, os linfócitos ficam resistentes aos efeitos imunossupressivos dos esteróides (14,15,16) nós examinamos sensibilidade dos linfócitos a glicocorticóides em idosos e jovens adultos. A DEX e cortisol produziram uma supressão dose-dependente significativa na proliferação de linfócitos (Figura 3), p < 0,0001. Estes dados enfatizam a eficácia destes esteróides na supressão da proliferação celular in vitro. Nós observamos ainda que os linfócitos dos idosos eram menos sensíveis para o tratamento de GC in vitro comparados aos linfócitos dos jovens adultos. Em particular, foi observado que os linfócitos dos idosos exigiram concentrações de DEX mais altas suprimir proliferação com PHA do que linfócitos dos jovens, F(1,72) = 8,19, p = 0,006. Embora tratamento com cortisol produziu um efeito semelhante, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas, F(1,66) = 1,64, p = 0,20.


Figura 3. O envelhecimento está associado com uma redução na sensibilidade linfocitária a dexametasona. A sensibilidade para glicocorticóides foi determinada incubando células mononucleares do sangue periférico com PHA (1%) e concentrações crescentes de dexametasona ou cortisol. Os resultados são apresentados como porcentagem da proliferação basal (PHA 1%, sem glicocorticóides).** p < 0,01 e* p < 0,05.


Figura 4. O estresse altera a sensibilidade linfocitária a dexametasona no envelhecimento. A figura apresenta a resposta linfocitária a DEX em grupos de idosos sem estresse (idosos, n=11), idosos com sintomas de estresse (idosos + estresse, n=35), jovens sem estresse (jovens, n=23) e jovens com sintomas de estresse (jovens + estresse, n=9).

Além disso, analisamos se o estresse no envelhecimento poderia alterar a resposta de proliferação bem como sensibilidade a GCs. Análises ANOVA multivariadas produziram uma interação significativa entre o grupo e estresse, F(1,69) = 6,61, p = 0,01. Em particular, foi constatado que os linfócitos dos idosos sem sintomas de estresse são mais resistentes a DEX que os idosos com estresse ou jovens sem estresse (Figura 4). Nenhuma interação significativa foi observada para a proliferação induzida por PHA ou sensibilidade a cortisol.

DISCUSSÃO

O envelhecimento está associado com várias doenças imunes, inclusive neoplasias, doenças auto-imunes e infecciosas. Porém, esta a susceptibilidade não é distribuída uniformemente em populações de idosos, o que representa a possível influência de outros fatores imunomoduladores. Neste estudo, analisamos o papel de fatores psicológicos e endócrinos na regulação da imunidade celular nos idosos. Para controlar para as doenças relacionadas à idade pudesse, foram recrutados indivíduos estritamente saudáveis através do protocolo SENIEUR (7), que estabelece critérios rigorosos para seleção de indivíduos estritamente saudáveis.

Apesar de serem estritamente saudáveis, os idosos estavam significativamente mais estressados, deprimidos e ansiosos que os jovens adultos. Contudo é importante salientar, que os idosos não apresentavam subjetivamente sintomas de depressão clínica ou estresse crônico. Todos são idosos não institucionalizados e os indivíduos socialmente ativos na comunidade. Apesar de alguns estudos considerem que mudanças as psicológicas relacionadas a idade controvertida e outros ainda não observaram tais mudanças (6), é provável que, tais evidências podem estarem relacionados à falhas metodológicas, uma vez que não são exigidos instrumentos clínicos específicos para avaliar a depressão no idoso. Por exemplo, muitos dos idosos não relatam sintomas de tristeza e fadiga claramente e tendem a omitir seus sentimentos para agir mais defensivamente as perguntas que podem constituir uma ameaça a sua auto-estima (17).

Paralelamente as mudanças psicológicas, nós observamos que os idosos apresentavam aumento dos níveis de cortisol salivar ao longo do dia. Estes dados apóiam estudos prévios (18) e sugerem que o envelhecimento humano está associado a uma hiperativação do eixo de HPA. Essa alteração neuroendócrina pode ser devida a alguns problemas do controle do eixo central, como uma diminuição do número de neurônios no hipotálamo e hipocampo, implicando numa redução nos receptores de glicocorticóides e uma diminuição na capacidade de regulação do eixo HPA (19). Em outro estudo, nós demonstramos que idosos cronicamente estressados apresentavam níveis aumentados de cortisol salivar quando comparados com idosos não estressados (16), e no presente estudo, nós evidenciamos que em idosos saudáveis, os escores aumentados para depressão, ansiedade e estresse estão correlacionados positivamente o aumento dos níveis de cortisol salivar. Estes resultados corroboram também estudos que observaram uma hiperativação do eixo de HPA na depressão clínica (20). Estes dados sugerem que fatores psicológicos podem ser implicados na ativação do eixo HPA no envelhecimento saudável.

De acordo com outros estudos (21), nós também verificamos que os idosos apresentaram uma redução significativa (~30%) da proliferação celular estimulada por mitógenos comparados aos jovens adultos. A diminuição da proliferação celular é uma mudança relacionada à idade que foi já observada em diferentes espécies. Esta diminuição pode contribuir para uma resposta imune pobre contra novos antígenos e estar associada com o aumento de morbidade e mortalidade no idoso. Esta mudança celular pode estar relacionada a vários mecanismos subjacentes, incluindo a involução tímica, alterações nas citocinas, função diminuída das células apresentadoras de antígenos e da senescência replicativa (2).
Neste estudo, nós também investigamos a sensibilidade dos linfócitos a glicocorticóides sintéticos. Verificamos que os idosos saudáveis apresentavam uma reduzida sensibilidade dos linfócitos in vitro para DEX (mas não para cortisol) quando comparados com os jovens adultos. Estes dados sugerem que no envelhecimento, os linfócitos parecem ser mais resistentes à ação dos glicocorticóides in vitro. Em nosso estudo anterior demonstramos que no estresse crônico os linfócitos são mais resistentes para tratamento de GC in vitro quando comparados com idosos não estressados (16) e no presente estudo, apresentamos dados de que no envelhecimento saudável, os linfócitos também são resistentes ao tratamento a glicocorticóides in vitro. Nossos resultados sugerem no envelhecimento, a resistência de linfócitos ao tratamento a glicocorticóides possa ser uma característica do envelhecimento que pode ser modificada pelo estresse. Sugerimos que níveis de cortisol elevados tornam os linfócitos menos sensíveis aos efeitos dos glicocorticóides in vitro. Existem algumas evidências na literatura que sugerem que a mudança na sensibilidade a GC poderia ser o resultado do tratamento crônico com GC (22,23). A alteração da imunorregulação por glicocorticóides pode ter implicações terapêuticas importantes em situações clínicas onde são administrados GCs. Por exemplo, a partir dos nossos dados, espera-se que os pacientes idosos com doenças auto-imunes ou inflamatórias respondam mais fracamente ao tratamento com GCs e, desta forma, a terapêutica moderna deverá levar em conta a idade bem como o estado emocional do paciente. Além disso, a resistência adquirida a GCs pode contribuir para a própria etiologia das doenças auto-imunes, aonde o excesso de cortisol fisiológico, observado durante o estresse ou infecções, não consiga controlar a ativação crônica do sistema imune. Em conclusão, nós demonstramos pela primeira vez que fatores de psiconeuroendócrinos estão correlacionados a alterações que caracterizam o processo de imunossenescência. Nossos dados sugerem que o envelhecimento está associado com mudanças na imunorregulação que podem estar relacionadas à ativação do eixo HPA.

AGRADECIMENTOS

Gostaríamos de agradecer o excelente apoio técnico da Sra. Ingrid Manfredi (Escritório para Cuidado Social, Gravataí). Nós agradecemos para a prefeitura de Gravataí fornecer a infraestrutura para o recrutamento e transporte dos idosos. Ainda, gostaríamos também de agradecer a DPC-Medlab (São Paulo, Brasil) pelas doações dos kits e ao Dr Luiz Glock pelo apoio estatístico. Este estudo foi financiado pela FAPERGS (#00/0168- 9, M.E.B.) e CNPq (#551180/01-3, M.E.B.).

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Malaguarnera L, Ferlito L, Imbesi R et al. Immunosenescence: a review. Arch.Gerontol.Geriatr. 2001; 32: 1-14.
2. Pawelec G, Barnett Y, Forsey R et al. T cells and aging, January 2002 update. Front Biosci. 1-5-2002; 7: d1056-d1183.
3. Halbreich U, Asnis G, Zumoff B et al. Effect of age and sex on cortisol secretion in depressives and normals. Psychiatr.Res. 1984; 13: 221-229.
4. Bauer M Estresse: como ele abala as defesas do corpo? Ciência Hoje 2002; 30: 20-25.
5. Schweiger U Menstrual function and luteal-phase deficiency in relation to weight changes and dieting. Clin.Obstet.Gynecol. 1991; 34: 191-197.
6. Nolen-Hoeksema S, Ahrens C Age differences and similarities in the correlates of depressive symptoms. Psychol.Aging 2002; 17: 116-124.
7. Litghart G, Corberand J, Fournier C et al. Admission criteria for immunogerontological studies in man: the SENIEUR protocol. Mech.Ageing Dev. 1984; 28: 47-55.
8. Yesavage JA, Brink TL, Rose TL et al. Development and validation of a geriatric depression screening scale: a preliminary report. J.Psychiatr.Res. 1982; 17: 37-49.
9. Shua-Haim JR, Haim T, Shi Y et al. Depression among Alzheimer's caregivers: identifying risk factors. Am.J.Alzheimers.Dis.Other Demen. 2001; 16: 353-359.
10. Lipp M, Guevara A Validação empírica do inventário de sintomas de stress. Estudos de Psicologia 1994; 11: 43-49.
11. Kirschbaum C, Hellhammer D Salivary cortisol in psychoneuroendocrine research: recent developments and applications. Psychoneuroendocrinol. 1994; 19: 313-333.
12. Kahn.J., Rubinow D, Davis C et al. Salivary cortisol: a practical method for evaluation of adrenal function. Biol.Psychiat. 1988; 23: 335-349.
13. Collaziol D, Preissler T, Bauer M Avaliação da proliferação linfocitária e sensibilidade a glicocorticóides por ensaios colorimétricos. Revista de Medicina da PUCRS 2002; 12: 226-231.
14. Rupprecht R, Wordarz N, Kornhuber J et al. In vivo and in vitro effects of glucocorticoids on lymphocyte proliferation in depression. Eur.Arch.Psychiatry Clin.Neurosci. 1991; 241: 35-40.
15. Wodarz N, Rupprecht R, Kornhuber J et al. Normal lymphocyte responsiveness to lectins but impaired sensitivity to in vitro glucocorticoids in major depression. J.Affect.Disorders 1991; 22: 241-248.
16. Bauer M, Vedhara K, Perks P et al. Chronic stress in caregivers of dementia patients is associated with reduced lymphocyte sensitivity to glucocorticoids. J.Neuroimmunol. 2000; 103: 84-92.
17. Snowdon J Prevalence of depression in old age. Br.J.Psychiatry 2001; 178: 476-477.
18. Ferrari E, Cravello L, Muzzoni B et al. Age-related changes of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis: pathophysiological correlates. Eur.J.Endocrinol. 2001; 144: 319-329.
19. Mani RB, Lohr JB, Jeste DV Hippocampal pyramidal cells and aging in the human: a quantitative study of neuronal loss in sectors CA1 to CA4. Exp.Neurol. 1986; 94: 29-40.
20. Stokes PE The potential role of excessive cortisol induced by HPA hyperfunction in the pathogenesis of depression. Eur.Neuropsychopharmacol. 1995; 5 Suppl: 77-82.
21. Murasko D, Weiner P, Kaye D Decline in mitogen induced proliferation of lymphocytes with increasing age. Clin.Exp.Immunol 1987; 70: 440-448.
22. Kloet E Brain corticosteroid receptor balance and homeostatic control. Frontier Neuroendocrinol. 1991; 12: 95-164.
23. Chiappelli F, Manfrini E, Gwirtsman H et al. Steroid receptor-mediated modulation of CD4+CD62L+ cell homing. Ann.N.Y.Acad.Sci. 1994; 746: 421-425.